Entenda o que você deve levar em consideração ao escolher a metodologia de sequenciamento para o seu projeto de pesquisa.
Por Marina Veiga da Silva Amorim
Bióloga, Mestre em Neurociências e Auxiliar em Gestão de Projetos e Clientes na BiomeHub.
Neste postblog abordaremos:
Métodos Moleculares para Pesquisa em Microbioma
No estudo dos microbiomas, dois métodos moleculares se destacam como amplamente utilizados: sequenciamento de amplicons e metagenômica. Essas técnicas desempenham um papel crucial na pesquisa, permitindo a identificação da composição taxonômica, a estimativa de interações entre microrganismos e a análise de funções metabólicas com base no DNA presente em amostras.
A escolha entre sequenciamento de amplicons e metagenômica depende de diversos fatores. Entre eles, destacam-se:
Microrganismos de interesse: Quais grupos ou espécies você deseja estudar?
Origem da amostra: Direfentes amostras podem requerer abordagens diferentes.
Sensibilidade e especificidade: Qual o nível de detalhe necessário para os resultados?
Tempo e recursos disponíveis: Orçamento e prazos podem influenciar a escolha da técnica mais adequada.
Ao compreender as particularidades de cada método, é possível otimizar os resultados da pesquisa e obter insights valiosos sobre a diversidade microbiana e suas funções ecológicas.
Mas afinal, qual o melhor método: Sequenciamento de amplicons ou metagenômica?
Apesar de ambas as técnicas terem o objetivo de identificar e caracterizar comunidades microbianas, podem se diferenciar em seus processos e na profundidade dos dados que oferecem.
O sequenciamento de amplicons (16S rRNA) utiliza regiões específicas do gene ribossomal como marcadores para identificar bactérias,
Já a metagenômica (shotgun) sequencia todo o DNA presente na amostra (independente do organismo), permitindo análises mais detalhadas.
Veja o quadro abaixo com as principais diferenças entre os dois métodos, considerando o foco do projeto, vantagens de cada um e suas aplicações.
Limitações das técnicas de sequenciamento
Embora ambas as técnicas ampliem os estudos do microbioma, elas apresentam limitações que devem ser consideradas ao planejar sua pesquisa.
SEQUENCIAMENTO DE AMPLICONS:
Possui resolução limitada para microrganismos muito próximos filogeneticamente, dificultando a identificação ao nível de espécie e linhagem. Além disso, não fornece informações funcionais detalhadas de genes e vias metabólicas.
METAGENÔMICA SHOTGUN:
Oferece mais especificidade, chegando a distinguir microrganismos até o nível de linhagem. Porém é mais cara e exige recursos mais avançados de análises de bioinformática. Essa metodologia também apresenta desafios como a interferência de DNA não-alvo (exemplo: DNA humano em amostras clínicas) diminuindo assim sua sensibilidade para microrganismos menos abundantes na amostra).
Compreender essas limitações é necessário para selecionar a melhor técnica que se alinhe aos objetivos do seu estudo.
Como escolher a melhor técnica para a sua pesquisa ?
Diferentes metodologias de análise molecular podem gerar diferentes resultados, muitas vezes complementares, de forma que não se pode dizer que existe a melhor técnica. Todos os métodos tem seus pontos fracos e fortes. Várias questões precisam ser analisadas frente aos dados biológicos e as respostas que se espera obter.
Assim a escolha entre amplicons (16S) e metagenômica shotgun depende do objetivo da sua pesquisa:
Se o foco for taxonômico: o sequenciamento de amplicons é suficiente para caracterizar microbiomas. No entanto, se o foco for a diferenciação até nível de linhagem, deve se considerar utilizar a técnica de metagenômica shotgun.
Se o foco for funcional: A metagenômica shotgun pode identificar genes, vias metabólicas e realizar análises mais detalhadas.
Considerações sobre a amostra: Em amostras ricas em DNA humano (como saliva ou pele) o sequenciamento de amplicons pode oferecer maior custo-benefício já que para a técnica de shotgun amostras ricas em DNA humano causam muita interferência, sendo necessária uma cobertura de sequenciamento muito alta para detecção dos microrganismos.
Tabela comparativa resumida
Confira a tabela comparativa resumida entre os métodos de sequenciamento disponiveis na BiomeHub. Agora, com as informações claras, ficou mais fácil definir a metodologia adequada
para o seu projeto.
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Referências:
Jovel, Juan et al. “Characterization of the Gut Microbiome Using 16S or Shotgun Metagenomics.” Frontiers in microbiology. 2016. doi:10.3389/fmicb.2016.00459
Knight, Rob et al. “Best practices for analysing microbiomes.” Nature reviews. Microbiology. 2018 doi:10.1038/s41579-018-0029-9
Tessler, Michael et al. “Large-scale differences in microbial biodiversity discovery between 16S amplicon and shotgun sequencing.” Scientific reports. 2017. doi:10.1038/s41598-017-06665-3